westernblot原理及应用，实验技术及常见问题分析

关于【westernblot原理及应用】，今天小编给您分享一下，如果对您有所帮助别忘了关注本站哦。

• 内容导航：
• 1、westernblot原理及应用：Western blot 实验技术及常见问题分析
• 2、westernblot原理及应用，blot实验的若干细节

1、westernblot原理及应用：Western blot 实验技术及常见问题分析

Western blot基本原理：

在电场的作用下将电泳分离的多肽从SDS-PAGE凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。

Western blot应用：

目的蛋白的表达特性分析；

目的蛋白与其他蛋白的互作；

目的蛋白的组织定位；

目的蛋白的表达量分析；

蛋白样品的制备：

1 水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解 度大，是提取蛋白质最常用的的溶剂，操作相对麻烦，重复性一般；

2 有机溶剂提取法；

3 离心管柱提取法：超快速，易用，高产及重复性强；

4 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。

Western blot注意事项和常见问题：

1 我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？

答：有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长； 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。

2 我做的蛋白质分子量很小（10 KD），请问怎么做WB？

答：可以选择0.2 μm的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。

3

最后显色时用 DAB好还是ECM好？

答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级蛋白，具体可以根据你实验的情况。

4 要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？

答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western

blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定 量，但是不能定位。

②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

5 细胞水平要做western blot，多少细胞提的蛋白够做western blot？

答：一般5×106就足够了。

6 同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对western blot有无影响？

答：能，没有问题。

7

同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？

答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。

8 蛋白变性后可以存放多久？

答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。

9 二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？

答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点。

10 做组织样品的western的时候，怎样处理样品？

答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性。

11 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？

答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。

12 在做Western Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？

答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

13 检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？

答：可以。

14 蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？

答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAGE，湿转120mA， 45-60min就可以了， 可以根据你实验室的经验调节；170kd 用 7% SDS－PAGE，200mA 90-120min。

15 细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？

答：一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。若有特殊要求可以选择相应的蛋白酶抑制剂。

16 PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？

答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。

17 westernblot内参选择什么合适？

答：这与目标抗原的表达位置有关，对于胞浆和全细胞蛋白，可选择内参β-actin、GAPDH和Tubulin；线粒体蛋白则可选择内参VCDA1/Porin和COXIV；核内抗原可以选择内参Lamin B1、TBP和histone。

18

不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低？

答：转移缓冲液中加入20% 甲醇（终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也能增加转移效率；使用戊二醛交联；降低凝胶浓度，如低至6-7%或提高转膜电压/电流，增加转移时间。

19

转膜时凝胶肿胀或卷曲？

答：可将凝胶在转膜前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min。

20

跑胶的条带歪斜或者漂移？

答：电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致，可更换或者在两块海绵之间垫上少许普通的草纸。

21

转膜后膜上有单个或多个白点？

答：转膜时确保膜和胶块之间没有气泡。

22

转膜缓冲液过热？

答：缓冲液中离子浓度太低，电流或者电压过高，转膜过程中注意降温。

23

显影后胶片背景太高？

答：转膜前PVDF膜没有用100%甲醇完全浸湿；洗膜不充分，可以增加膜洗涤次数；封闭不完全，选择合适的封闭液和提高封闭时间；二抗浓度过高，降低二抗浓度；一抗特异性不强，换用特异性较强的单克隆抗体；曝光时间过长，减少曝光时间。

24

结果没有条带或者条带很浅，杂交信号很弱？

答：样品中不含靶蛋白或者含量太低，可增加蛋白上样量，设置已知标准量蛋白的对照；抗体稀释比例太低，孵育时间不够；转膜不好，转膜后可先用丽春红染色观看染色效果；曝光时间过短，增加曝光时间；抗体保存不当，效价降低。

25

目的条带位置偏低或者偏高？

答：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶，小分子蛋白要用高浓度胶。

26

有非特异性条带？

答：目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带；一抗特异性不好，换用特异性较好的单克隆抗体；二抗非特异性引起的结果，可设立一组不加一抗只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异性结合；样品蛋白质可能降解，提取蛋白时注意冰上操作，加入适当的蛋白酶抑制剂，避免样品反复冻融；抗体浓度过高，降低一抗和二抗的浓度。

27

胶片是一片空白，是怎么回事？

答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；ECM底物中H2O2，不稳定，失活；ECL底物没覆盖到相应位置；二抗失活。

28

目的条带是白色，周围有背景？

答：目的蛋白含量太高；一抗浓度偏高，二抗上HRP催化活力太强。

2、westernblot原理及应用，blot实验的若干细节

原理：

蛋白质免疫印迹（Western Blot）是用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。电泳分离后的蛋白质从凝胶转移到固相载体（如PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变，以其作为抗原，与对应的第一抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体反应，经过底物显色或放射自显影，通过观察着色的位置和着色深度等，可获得蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况及蛋白成分等信息。

关于蛋白提取：

1. 裂解buffer：每种裂解buffer都有其擅长的用途，市面上常见的裂解buffer见下表：

Tips：

除了这些裂解buffer以外，为了防止蛋白降解、去磷酸化，各种蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂都是必须的；在提取蛋白的时候仅仅靠裂解液有时候也不能达到完全抽提的效果，有条件的话，可以对抽提悬液进行10-20s的超声破碎处理；此外如果没有裂解buffer，可以用1×SDSloading buffer代替来抽提蛋白，其效果类似于SDS裂解液，不过抽提后的样本不能进行浓度测定。

2. 干扰蛋白：培养细胞、动物组织都存在血清成分，血清中存在大量的白蛋白与免疫球蛋白，这些蛋白会经常性的出现杂带干扰，一般白蛋白杂带在70kDa处，免疫球蛋白杂带出现在50kDa处；有人怀疑：“我的抗体也不识别这些蛋白啊！”，现实不是这样的，当某种蛋白含量超过一定量的时候，即使很少的非特异吸附都有可能造成信号的富集而造成杂带；建议广大战友在提取细胞蛋白的时候，一定要使用PBS漂洗细胞至少3次，去除残留的培养基成分；提取组织的时候，尽量去除组织中血液的残留，这样样本中的干扰因素才会减少到最低。

2

关于胶浓度及电泳条件的选择：

正确选择凝胶浓度与电泳条件能够让目的蛋白区域最大限度的分离开，从而使条带的位置，杂带位置等一些因素的影响降到最低；胶浓度及电泳条件的选择见下表：

3

关于转膜的条件与注意事项：

1

转膜条件：

对于分子量10-15kDa的指标转膜时间不宜过长，100V、冰浴45min足矣；对于分子量指标150kDa以上的指标，100V、冰浴2h也足够了；其他介于15-150kDa之间的指标100V、冰浴1h完全可以保证效果。

2

转膜操作：

准备PVDF膜的大小要与切割后的凝胶大小一致或略小，滤纸和海绵大小也要一致；制作“三明治”不能太厚也不能太薄，太厚容易使胶变形，条带弯曲，太薄气泡容易进入，导致条带不完整，这些都可以用增加减少滤纸量来改善；一定要把目的蛋白分子量区域贴在膜的中间部位；分清楚正极与负极，避免反方向转印；转印缓冲液要提前预冷，整个转印过程也需要在冰浴中进行。

4

关于分子量实际与预测结果的差异：

1

预染marker的误差：

由于预染marker是由标准蛋白与有色染料偶联而成的，所以偶联后的蛋白由于表面结构的改变，导致在SDS-PAGE中分离的线性关系没有天然蛋白那么好；另外由于偶联的批次不同，每个条带针对每个批次呈现出的分子量会有些许的变化，所以在使用预染marker的时候，出现5-10%的分子量误差是不能避免的，如果需要确切分子量需要用非预染marker来标定；

2

物种差异：

很多蛋白在人源、大鼠源、小鼠源中存在的长度并非完全一致，具体问题还要具体分析；

3

蛋白本身的性质：

①分子量数值仅仅是一个氨基酸数值累加的相对值，与实际值本身存在差距；

②蛋白质存在磷酸化、乙酰基化、糖基化等翻译后修饰可导致分子量增大，比如常见的CD家族蛋白糖基化修饰以后分子量都会增大许多；

③蛋白质存在翻译后酶前体状态与激活剪切状态，可使分子量变小，比如MMP2蛋白，酶源与激活态大小分别是72kDa、63kDa；

④蛋白质存在多个转录本由一个基因编码的形式，不同的转录本翻译得到的蛋白分子量不一样，比如JNK这个蛋白，本身分为JNK1，JNK2，JNK3三个亚型，三种亚型同源性较高，而且针对每个亚型还有不同分子量的转录本呈现；要想正确把握蛋白分量问题不仅仅要读说明书，还要关注这个蛋白的相关背景知识；

5

关于封闭

封闭也是Western中比较关键的环节，一般常规的条件是5%脱脂奶粉溶于1×TBST中，常温下摇床缓慢摇晃，封闭1h；除此之外还需要向大家介绍另外一种封闭液—0.5% 明胶，这两种封闭液都适用于常规的Western实验，他们之间的取舍关系可近似认为，如果用脱脂奶粉封闭结果是“白板”或者信号较弱，可以考虑换明胶；如果用明胶封闭，结果杂带较多，背景较深可以考虑用脱脂奶粉；甚至有的时候两者可以混合起来使用，具体的细节需要大家在实验中细细品味。

在Western Blot实验中通常需要注意以下几个问题:

1. 免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关.因此,凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太低,如果过低应该重新纯化和浓缩使用,或者建议做一次梯度稀释,上样电泳后,直接考马斯亮蓝染色选择最佳上样量,纯化和浓缩的蛋白质样品必须注意盐的浓度过高,可平衡一下盐的浓度,如,透析。

2. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度,激活剂的浓度适当,不仅可以决定凝胶聚合的速度,也将影响凝胶的质量,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度.因此,建议要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15-20分钟最佳,对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟开始可见聚合.灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合。

3. 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免枕头刺入胶内。

4. 电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺,同时建议低电压短时间的预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10-20V,20-30min)。

5. 加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象。

6. 为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。

7. 样品缓冲液中煮沸的样品可在-20存放数,,但是反复冻融会使蛋白质降解。

8. 为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印。

9. 上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。

10. 取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应用同样的方法对NC膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系。

11. 转膜时应依次放好NC膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,NC膜对应正极。

本文关键词：western blot原理和步骤ppt，western blot原理以及操作步骤，westernblot的应用，westernblotting原理，western blotting原理及步骤。这就是关于《westernblot原理及应用，实验技术及常见问题分析》的所有内容，希望对您能有所帮助！