富集微生物的原理，高中生物-微生物的培养与应用

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1、富集微生物的原理：高中生物-微生物的培养与应用

微生物的培养与应用

课题一 微生物的实验室培养

一、培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。

1、种类·培养基按照物理性质可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。

·按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。

·按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。

选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。

鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。

2、、化学成分包括 ：水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源（有些可加生长因子、维生素）等。

·碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。

·氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）、蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。

·培养基还要满足微生物生长对PH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件。

3、配置原则

（1）目的明确：

（2）营养物质要协调，注意各营养物质的浓度和比例

（3）PH要适宜，各种微生物适宜生长的PH值范围不同。

二、无菌技术：消毒和灭菌

1、消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。

消毒方法：常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。

2、灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。

灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。

3、灭菌方法：

①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；

②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱；

③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。

④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。

比较项

理化因素的作用强度

消灭微生物的数量

芽孢和孢子能否被消灭

消毒

较为温和

部分生活状态的微生物

不能

灭菌

强烈

全部微生物

能

三、实验操作

（一）、制作牛肉膏蛋白胨固体培养基方法步骤：

计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。

5、倒平板操作的讨论

①培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？

答：可用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。

②为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。

③平板冷凝后，为什么要将平板倒置？

答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

④在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？

答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。

（二）、纯化大肠杆菌

1、微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。

2、用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。

3、平板划线操作的讨论：

①为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。

②在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？

答：以免接种环温度太高，杀死菌种。

③在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

4、涂布平板操作的讨论

涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，接种应如何进行无菌操作？

提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。

（三）、恒温箱培养：不同的微生物培养温度不同，一般是37°C恒温箱中，培养12~14小时。

（四）、菌种的保存

（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。

①临时保藏方法

将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。

②缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。

（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。

13、疑难解答

（1）微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。

（2）确定培养基制作是否合格的方法：将未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。

课题二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

尿素：是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶，尿素最初是从人的尿液中发现的。

一、研究思路

1、筛选菌株

思路：寻找目的菌株时要根据它对生存环境的要求到它适应生长的环境中去寻找。

（1）实验室中微生物的筛选应用的原理

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

（2）选择性培养基

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。

（3）配制选择培养基的依据

根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。

2、统计菌落数目

（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。

（2）采用稀释涂布平板法计数的注意事项：①一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数②本法仅限于形成菌落的微生物。

（3）设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。

3、实验设计

（1）土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样。

（2）制备培养基：制备一尿素为唯一氮源的选择培养基

（3）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。

·测定土壤中细菌的数量，一般选用104、105 、106

·测定放线菌的数量，一般选用103、104 、105

· 测定真菌的数量，一般选用102、、103、 104

（4）取样涂布

（5）微生物的培养与观察

不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。

（6）细菌的计数

【旁栏思考题】

如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？

统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值。

每克样品中的菌落数=（C/V）×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数

“微生物的培养与应用”知识归纳

　　一、知识归纳

1、培养基的分类和应用

划分标准

培养基种类

特点

用途

物理性质

液体培养基

不加凝固剂

工业生产

半固体培养基

加凝固剂，如琼脂

观察微生物的运动、分类、鉴定

固体培养基

加凝固剂，如琼脂

微生物分离、鉴定、活菌计数

化学组成

天然培养基

含化学成分不明确的天然物质

工业生产

合成培养基

培养基成分明确（用化学成分已知的化学物质配成）

分类、鉴定

目的用途

选择培养基

培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长

培养、分离出特定微生物

鉴别培养基

根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品

鉴别不同种类的微生物

2、消毒与灭菌的区别

比较项目

消毒

灭菌

条件

使用较为温和的理化方法

使用强烈的理化因素

结果

杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）

杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子

适用

实验操作的空间、操作者的衣服和手

微生物的培养器皿、接种用具和培养基等

常用方法

煮沸消毒法（如在100℃，煮沸5～6 min）、巴氏消毒法（如在80℃，煮15 min）；使用酒精、氯气、石炭酸等化学药剂进行消毒

灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌

3、三种常用灭菌方法的比较

灭菌方法

灭菌条件

灭菌时间

适用材料或用具

灼烧灭菌

酒精灯火焰的充分燃烧层

直至烧红

接种环、接种针或其他金属工具

干热灭菌

干热灭菌箱内，160～170℃

1～2 h

玻璃器皿（吸管、培养皿）

和金属用具等

高压蒸汽灭菌

100kPa，121℃

15～30 min

培养基等

4、微生物的纯化培养

包括培养基的制备和纯化微生物两个阶段，纯化微生物时常用的接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法。

平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后，就可以得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。

稀释涂布平板法：将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。

微生物的培养与应用相关知识拓展

发酵工程，是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。

富集培养是微生物学中最强有力的技术手段之一。主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定环境条件使仅适应该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。富集条件可根据所需分离的微生物的特点，从物理、化学、生物以及综合多个方面进行选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等许多方面。下图描述了采用富集方法从土壤中分离能降解对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。

(1)本实验所需培养基为____________，碳源为_____________。
(2)实验原理是_________________________。
(3)①→③重复培养的目的是______________________。
(4)⑤的菌落中大部分是降解__________的微生物。
(5)⑥为_______组，⑦为________组，设置⑥的目的是_____________。
(6)⑤→⑥采用_______法，接种到⑥的培养基中，在操作过程中为防止污染应注意的事项是__________。

答案

(1)选择培养基 对羟基苯甲酸
(2)利用以对羟基苯甲酸为唯一碳源的选择培养基，经富集培养，分离出能降解对羟基苯甲酸的微生物
(3)增大对羟基苯甲酸微生物的比例
(4)对羟基苯甲酸
(5)对照 实验 说明通过富集培养的确得到了欲分离的目标微生物
(6)单细胞挑取 接种环在火焰上灼烧灭菌，烧红的接种环在空气中冷却，同时打开皿盖挑取菌种接种到试管中，并塞好棉塞，接种环在火焰上灼烧，杀灭残留物

例题1．现有一种能生产甲硫氨酸的M菌，但产量很低，而且当培养液中甲硫氨酸的含量达到最大值后，继续培养，甲硫氨酸含量会迅速下降。这是由于甲硫氨酸的积累反过来抑制了其合成。用紫外线照射可选育得到能抗甲硫氨酸抑制的高产新菌株。下列有关选育过程的表述，不正确的是

A．这种新菌株的选育方法属于用物理因素诱导的诱变育种

B．M菌培养液中甲硫氨酸的含量达到最大值后又不断减少是反馈调节的结果

C．用紫外线照射M菌的同时，还应在其培养基中添加甲硫氨酸

D．该选育过程中采用的培养基是液体培养基

答案D

例题2. (16分)焦化厂活性污泥中富含难降解的有机物苯甲酰胼,是当前焦化行业环保治理的难点。某同学通过查阅资料发现可通过细菌生物降解方法处理焦化厂污染物。请回答下列有关问题：

(1)目的菌的筛选：选择目的菌应该从_________中筛选，在配制培养基时仅加入 _________作为碳源，从功能上讲该培养基属于_________培养基,所选目的菌的同化作用类型是________。

(2)优质菌株的驯化：欲要选出高效降解污染物的优质菌株，需采用逐步提高_________的方法驯化目的菌，培养出的目的菌株经稀释涂布分离后得到_________以备鉴定和使用。

(3)优质菌株降解污染物能力的测定：将分离得到的优质菌株_________到经过 _________处理的污染物液体培养基中，在适宜条件下培养,一定时间后，测定残余污染物的浓度。

答案（16分）（1）焦化厂活性污泥（焦化厂污染物） 苯甲酰肼 选择 异养型 （2）苯甲酰肼浓度 单一菌落 （3）接种 灭菌

例题3．下列关于微生物培养和利用的叙述不正确的是

A．利用稀释涂布平板法只能分离微生物不能对微生物进行计数

B．接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单菌落

C．以尿素为唯一氮源且含酚红的培养基可选择和鉴别尿素分解菌

D．用大白菜腌制泡菜的过程中亚硝酸盐含量变化是先增加后减少

答案A

例题4.（16分）孔雀石绿(C23H25N2Cl)常用作纺织业的染料，也可用作水产养殖业的杀菌驱虫剂。但它具有高毒性、高残留的危害，因此对孔雀石绿废水的处理已成为环境科学领域关注的热点。科研人员从某化工厂污水池中分离获得了能降解孔雀石绿的细菌菌株A。主要步骤如图-25所示。

图-25

分析并回答：

（1）从①到③的培养过程中培养液应加入 作为唯一碳源，此过程的目的是

和 。

（2）使用 法可以在④上获得单个菌落。

（3）若要对获得的菌株A进行分类鉴定，可先利用 技术进行体外DNA扩增，此过程中采用 方法将DNA双链解开，而在菌株A体内，DNA复制时将双链解开则是在 的作用下完成的。

（4）研究人员进一步研究了不同金属离子对菌株A降解孔雀石绿的影响，实验结果如图-26。

由上述结果可以看出，与不加金属离子的对照组相比，多数金属离子对菌株A降解孔雀石绿有 作用，唯有Pb2+的作用相反。若要排除Pb2+本身对孔雀石绿有降解作用，则应设置 的培养基样本作为对照。

【答案】 （1）孔雀石绿 筛选出菌株A 增加菌株A的浓度（扩大培养）

（2）稀释涂布平板（或平板划线）

（3）PCR 控制温度 解旋酶

（4）抑制 含等量的Pb2+但不接种菌株A

【解析】本题考查微生物培养，DNA的复制

1. 分离能降解孔雀石绿的细菌菌株，则需要制作以孔雀石绿为唯一碳源的选择培养基，①②③过程可以筛选出菌株A，并且能增加菌株A的浓度。
2. 用稀释涂布平板或者平板划线法法可以在④上获得单个菌落。
3. DNA扩增一般采用PCR技术，用控制温度的方法将DNA解旋，而在细胞内，DNA双链在解旋酶的作用下解开。
4. 观察图，加入金属离子后，多数降解率都受到抑制变低；若要排除Pb2+本身对孔雀石绿有降解作用，则应设置含等量的Pb2+但不接种菌株A的培养基样本作为对照。

例题5．（16分）烹饪过程中产生的油烟冷却后形成液态的油脂，倾入下水道后会对环境造成污染。科研人员通过实验筛选出了能够高效分解油脂的微生物。请分析回答：

实验材料：烹饪油烟冷凝液（来自居民家厨房抽油烟机的油杯）、原始种子菌液（来自某城市污水厂曝气池污泥）、人工配制的营养液。

（1）实验过程（如下表所示）：

步骤

原始成分及体积

定容

培养

培养温度

获得菌种

1

250mL种子菌液、10mL烹饪油烟冷凝液、5mL营养液

500mL

6天

30℃

菌液a

2

100mL菌液a、20mL烹饪油烟冷凝液、5mL营养液

500mL

6天

30℃

菌液b

3

100mL菌液b、40mL烹饪油烟冷凝液、5mL营养液

500mL

6天

30℃

菌液c

从功能上分析此培养基属于—— 培养基。在培养过程中需通入空气并振荡培养，由此推测所培养的微生物的异化作用类型是—— 型，在生态系统中属于—— 。

（2）实验结果（如图所示）及分析：

① 实验结果显示—— 菌液适合在实际工程中应用，原因是—— 。

② 若在上述培养基中加入—— ，接种培养后，通过观察—— 特征，可以初步鉴别菌液中微生物的种类。以上三种菌液中—— 菌液的微生物种类最多。

答案（每空2分，共16分）

（1）选择 需氧（型 ） 分解者

（2）① c 菌液c中油的浓度下降最快（菌液c中油分解速率最大、降解速度最快）

②琼脂 菌落 a

新陈代谢类型

新陈代谢类型：包括同化作用（自养型和异养型）和异化作用（需氧、厌氧、兼性厌氧型）。

同化作用的实质是：合成自身物质（有机物），并贮存能量，那么动、植物合成自身有机物所需的原料是否相同？不相同，正是所需原料的不同，把整个生物界的同化作用分为两种类型。即：自养型和异养型。

例：各种绿色植物——自养型 蘑菇——异养型

各种藻类植物——自养型 青霉——异养型

细菌——异养型

利用光能的自养型生物是绿色植物，它们能利用光能将无机物合成自身有机物，这种合成作用叫光能合成作用。有些自养型生物体内无叶绿素，不能利用光能，而是利用环境中无机物氧化释放出的化学能来合成自身物质，这种合成作用叫“化能合成作用”。

例如：硝化细菌、硫细菌、铁细菌，它们分别能使还原态N、S、Fe氧化，并利用氧化反应释放的能量（化学能）合成自身物质，贮存能量。

异化作用的不同类型

在异化作用的一些生理过程中，其中最关键最主要的是呼吸作用，所以异化作用是以呼吸作用的方式为分类依据的。呼吸作用方式分为有氧呼吸、无氧呼吸和兼性厌氧呼吸，所以异化作用的类型就分为需氧型、厌氧型和兼性厌氧型。

例题1．下图表示从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。下列与该实验相关内容的叙述中不正确的是

A．实验中所用的培养基①②③④均属于选择培养基

B．图中I、Ⅱ过程实现了对目标微生物的稀释

C．统计⑤处培养基中的菌落数并不一定代表接种到④上的活菌数

D．在⑤处培养基上形成菌落的微生物同化作用类型为异养型

答案B

例题2.（20分）从某地分离到能分泌纤维素酶的枯草杆菌，对此菌进行诱变，利用染色法筛选纤维素酶产量高的菌体。（染色法：染料和培养基中的纤维素发生颜色反应，当纤维素被菌体水解，培养基中会出现以菌落为中心的透明圈）

(1)实验材料：菌体悬液，紫外灯，添加__________为碳源的选择培养基，培养皿等

(2)实验过程及结果预期：

a.将菌体悬液稀释至适当浓度，平均分成甲、乙两组。

b.甲组用__________的紫外线照射一定时间，乙组不做处理。

c.__________接种至选择培养基上。

d．观察并测量__________的直径与相应菌落直径

e．若甲组中出现了纤维素酶产量高的菌体，其形成的菌落表现为__________比乙组相应值的平均值大。

(3)甲组中会出现纤维素酶产量不同的菌体，此现象是由于紫外线的照射改变了基因的 ，即发生了 （变异类型），体现了此变异的__________特点。

(4)枯草杆菌因没有__________系统，其分泌纤维素酶与真核细胞蛋白质的分泌方式不同。

(5)

若用液体培养基培养上述细菌，研究其数量变化规律，绘制出该菌的生长速率曲线如右图，据图描述此菌的种群数量的变化规律是__________。

答案.（20分）

(1) 纤维素

(2) b. 适当剂量(强度)

c. 将等量甲乙两组菌液

d．透明圈

e．透明圈的直径与相应菌落直径比值

(3) 结构（或碱基排列顺序） 基因突变 不定向

(4) 生物膜

(5) 先S型增长后下降（首先平稳随后增加再平稳之后下降）

例题3．组氨酸缺陷型沙门氏菌是由野生菌种突变形成的，自身不能合成组氨酸。将其接种在缺乏组氨酸的平板培养基上进行培养，有极少量菌落形成。2-氨基芴是一种致突变剂，将沾有2-氨基芴的滤纸片放到上述平板培养基中，再接种组氨酸缺陷型沙门氏菌进行培养，会有较多菌落出现。以下叙述不正确的是

A．在接种前，2-氨基芴和滤纸片须进行灭菌处理

B．若用划线法接种可以根据菌落数计算活菌数量

C．基因突变的可逆性与是否存在致突变剂无关

D．此方法可以用于检测环境中的化学致突变剂

答案B

例题4．（18分）某实验小组欲从土壤中筛选出能分泌淀粉酶的芽孢杆菌，设计实验步骤如下，请给予合理的补充。

（1）采样与培养：将采集的土样混匀后称取1g，置于经过—— 法灭菌处理的—— （填“固体”或“液体”）培养基中，28℃振荡培养。

（2）接种与选择：为避免培养液中菌体浓度过高，需将培养液进行 ——处理。之后，将菌液涂布接种于以—— 为唯一碳源的固体培养基上，30℃条件下培养。为避免污染，需将培养皿呈—— 状态放置。此外，为排除其他因素的影响，提高实验可信度，本步骤需设计 ——作为空白对照。

（3）筛选与纯化：将适量的碘液滴加在平板中的菌落周围，如果菌落周围的现象是—— ，则说明此种菌能够—— 。从平板中挑取实验效果明显的目的菌株，采用 ——法接种于新的培养基平板，可对菌株进行进一步的纯化。

答案．（每空2分，共18分）

（1）高压蒸汽灭菌；液体

（2）系列稀释（或“梯度稀释”）；淀粉；倒置；

未接种的空白培养基（或“接种等量无菌水的培养基”）

（3）出现透明圈；分泌淀粉酶使淀粉发生水解；（平板）划线

例题5．（15分）在调查某湖水中H细菌指数（1升水中含有的H细菌菌群数）的实验中，先将5升湖水水样浓缩至5毫升，然后各取浓缩水样1毫升，涂布到4个培养皿中培养，培养后统计的菌落数分别是42、38、55、18。实验引发出一系列的问题，请回答：

(1) 培养基中含有蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了_ ______ ___。

（2）配制好的培养基用____________法灭菌，并在 条件下接种。

（3）为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于___ ___中培养，培养的温度设定在37℃。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种__ ____作为对照进行实验。

（4）细菌培养产生的单个菌落在生态学中称为__________。 根据上述结果计算，被检水样的H细菌指数为__________。

（5）在培养H细菌的过程中发现了另一种X细菌，并进行了如下图所示的实验：

从生态学的角度分析，H细菌与X细菌之间的关系是____________。 X细菌周围H细菌不能生长和繁殖的原因最可能是__________________。

（6）干扰素是动物或人体细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，科学家用基因工程的方法生产干扰素时，用H菌作为—— ，常用的转化方法是，先用—— 处理细胞，使其处于感受态，然后将其与—— 在缓冲液中混合，最后通过—— 的表达检测干扰素基因是否成功导入。

（7）若X细菌感染特定人群，则X细菌对感染者来说属于免疫学中的______物质，如果X细菌侵入人体细胞内，则彻底消灭这些细菌所涉及的免疫有_____________。

答案（15分）（1）氮源、碳源

（2）高压蒸汽灭菌 无菌

（3）恒温培养箱 等量无菌水

（4）种群 45

（5）竞争 X细菌产生了不利于其他细菌生存的物质

（6）受体细胞 Ca2+ 重组表达载体（重组DNA分子） 标记基因

（7）抗原 细胞免疫和体液免疫（特异性免疫）

例题6. （16分）石油污染会造成某些生物的大量死亡或大量增加，引起生态系统的变化。运用生物修复技术已发展成高效、低成本、环境友好的污染治理方法，该方法主要是在污染地接种经驯化的高效微生物来提高生物降解污染物的速率。图1表示驯化降解石油成分菌株S25A1的方法。图2为不同N：P对石油降解的影响。请回答：

图1

图2

（1）在被污染的区域的S25A1菌能降解石油，该菌的代谢类型为____________，属于生态系统成分中的___________。

（2）研究人员用基因工程的方法增强S25A1菌株的降解能力，图中载体的化学本质为_______________，除标出的抗性基因外，还应具有________和__________的起点。

（3）实验中接种1的常用方法有____________和_______________，将其接种在固体培养基中，该培养基中除了必要的营养物质外，还需要添加____________，才能筛选出降解能力更强的菌株。

（4）在接种2中使用接种环接种前，需要用___________方法对接种环灭菌处理。

（5）从图2中可以看出，_____元素含量较高时，石油能够迅速降解。该元素在菌体细胞内可参与___________、____________等细胞结构的物质组成。

答案 （共16分，除特殊说明外每空1分）

（1）异养需氧型 分解者

（2）DNA 复制 转录（后两空顺序可颠倒）

（3）平板划线法 稀释涂布平板法 卡那霉素

（4）灼烧法 （2分）

（5）P （2分） 细胞膜（2分）、核糖体（2分）（后两空顺序可颠倒，其它答案合理给分）

例题7（16分）

赤霉病是由雪腐镰刀菌等真菌感染引起的，广泛发生在小麦等粮食作物上。雪腐镰刀菌代谢产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON，分子式为C15H20O6）严重影响禽畜生产和人体健康。请分析回答下列问题：

（1）下列微生物与雪腐镰刀菌的细胞结构类似的是 ——（选填选项前的符号）。

a．酵母菌 b．醋酸杆菌 c．毛霉 d．乳酸菌 e．大肠杆菌

（2）为探究DON的致畸性是否与细胞的染色体变异有关，可向动物细胞培养液中加入一定剂量的DON，在—— 培养箱中保温培养一段时间后，在显微镜下观察染色体的—— 。

（3）某同学为筛选专一降解DON的菌，配制了下列培养基，在适宜条件下培养：

实验步骤

取样

培养基

培养结果

Ⅰ

土壤样品

葡萄糖，(NH4)2SO4，K2HPO43H2O，

KH2PO4，NaCl，CaCl2，

Mg SO47H2O，加水定容

培养液a

Ⅱ

1mL培养液a

同上

菌落

Ⅲ

挑取单菌落

真菌培养基

培养液b

①为实现筛选目的，步骤Ⅰ所使用的培养基配方中，应去除—— 并加入—— 。

②为实现目的菌的分离和计数，步骤Ⅱ所使用的培养基中还应加入—— 制成平板，采用的接种方法是—— 。

③步骤Ⅲ的目的是—— 。

答案（16分，每空2分）

（1）a、c（答全给分）

（2）CO2 数目和形态（结构）（答全给分）

（3）① 葡萄糖 DON

② 琼脂 稀释涂布平板法

③快速增加目的菌的种群数量（扩大培养）

2、富集微生物的原理，CellChem.Biol.

引言

通过泛素蛋白酶体系统降解疾病相关蛋白的靶向蛋白降解嵌合体(PROTACs)已成为药物发现领域的革命性技术。当前多数PROTAC对靶蛋白和E3连接酶均使用可逆非共价配体。本综述则详尽探讨了共价配体(包含可逆和不可逆)在蛋白降解(TPD)中的作用及优势。

共价抑制剂

市场上约有60%的药物直接来自于天然产物，而许多天然产物则通过各种亲电弹头与靶标形成共价键来结合。但出于对共价药物脱靶及潜在毒性的担忧，共价药物的发展在很长一段时间内陷入停滞，随着越来越多广泛使用药物(阿司匹林、青霉素、奥美拉唑等)的共价机制被阐明及迈克尔受体类化合物(阿法替尼等)被成功应用，共价抑制剂才逐渐复苏且发现过程由偶然变得理性。与非共价抑制剂相比，靶向共价抑制剂(TCIs)的优点是显而易见的：高效力和高选择性，更少给药量，靶向难药靶标及避免耐药突变等。

共价反应机理有两步，第一步分子骨架与靶标形成高亲和力的可逆复合物，速率为Ki。然后弹头与亲核残基形成共价键，速率为k2。对不可逆抑制剂来说，k-2=0， k-2则代表了共价复合物EI返回非共价复合物E·I的趋势，当k-2不等于0时，为可逆抑制剂。(图1)

最近，无论是对靶蛋白还是E3连接酶，可逆和不可逆TCI在靶向蛋白降解领域的应用都大有势头。本文旨在展示这项策略的优势及潜力，以进一步扩大蛋白降解的靶标范围。

图1. 共价抑制剂的反应机理

图片来源于Cell Chem. Biol.

PROTAC

PROTAC是一个两头含有不同配体的化学分子，一头是结合E3连接酶的配体，另一头是结合细胞内蛋白的配体，这两个配体再由一段linker连接起来。这样的化学分子既可以结合E3泛素连接酶，又可以结合胞内蛋白，通过把靶蛋白招募到E3泛素连接酶附近来实现靶蛋白的多泛素化，最后被26S蛋白酶体降解。(图2)

图2. PROTAC介导的靶标降解的催化机理

图片来源于Cell Chem. Biol.

小分子抑制剂需持续占据靶蛋白的活性位点以阻断功能，属于“占位驱动”,因此需要药物剂量够大使靶点饱和；半衰期够长能持续抑制；亲和力够高能竞争过底物。这些要求带来一系列问题，如毒副作用，脱靶毒性及耐药。而PROTAC机制则是“事件驱动”，只提供结合活性，触发靶蛋白和E3酶结合从而引发降解，不需要直接抑制靶蛋白功能活性也不需要药物与靶蛋白长时间高强度地结合。具有靶向难药靶标的潜力并可减少毒副作用。

PROTAC迄今为止已成功降解的靶标种类有：激酶、多通道跨膜蛋白、细胞表面蛋白(PD-1)的溶酶体。另有两个分别针对雄激素受体和雌激素受体的PROTAC，ARV-110和ARV-471，目前进入治疗前列腺癌和乳腺癌的一期临床。一种治疗阿尔茨海默症的TATAC甚至被证明穿过了血脑屏障。对于这些不符合类药五规则的化合物来说是一个令人印象深刻的壮举。这些结果表明PROTAC方法有开发有效疗法的巨大潜力。

与靶蛋白不可逆共价结合的PROTAC

与靶标不可逆地共价结合，将消除PROTAC机制的上述优势。第一个PROTAC-1通过与MetAP-2共价结合来完成降解但因其E3连接酶募集部分渗透性差故并没有进行细胞测试。从那时起，关于PROTAC与靶标共价结合的报道就逐渐变少，可能是因为从药代动力学优化角度看失去了催化靶标转化这一重大缺点。而且对这类的功效一直有争议甚至对同个靶标降解有相互矛盾的报道。最近又有PROTAC用共价弹头成功降解靶蛋白的成功报道，包括ERK1/2、BTK和KRASG12C。

用小分子抑制剂靶向BTK已成为治疗CLL的一种有效验证的治疗策略。一线药物依鲁替尼使用丙烯酰胺亲电弹头不可逆地与BTK激酶结构域中的Cys481结合。为了评估共价结合对PROTAC介导的BTK降解的影响，Tinworth等人合成了非共价和基于依鲁替尼的共价PROTAC用于比较研究，招募E3酶的配体来自凋亡蛋白抑制剂IAP。共价PROTAC2和可逆PROTAC3在生化分析中显示出对BTK的抑制作用但前者在细胞测试中并未观察到BTK降解，更换招募E3酶的配体为结合CRBN配体时也出现了类似的结果。于是作者得出结论共价键会抑制靶标降解，这是由于泛素转移到表面赖氨酸的损伤或阻碍了蛋白酶体识别所需的靶蛋白内在无序区域的呈现。薛等人的最新报告提出了一种成功降解BTK的共价PROTAC。合成的一系列PROTAC利用了两种与BTK结合部分不同的共价配体：依鲁替尼类似物和PLS-123，两者亲和力高且骨架有显著差异，招募E3酶的配体也有两种，分别结合CRBN和VHL。基于依鲁替尼类似物的CRBN PROTAC的BTK降解水平为50%，基于PLS-123的CRBN PROTAC则可以提高降解水平到75%。后续更换招募配体为VHL032时，比结合CRBN的配体降解BTK的水平更高，基于依鲁替尼的PROTAC最大BTK降解达到88%。将丙烯酰胺弹头更换为饱和的丙酰胺后的PROTAC9为可逆化合物，细胞实验表明，共价PROTAC7降解BTK的程度更大，此外，对BTK的IC50值表示PROTAC7是更有效的BTK抑制剂和降解剂。(图3)

另一种说法认为，这些研究的差异可能与靶标降解和共价键形成的相对速率有关，Gabizon等观察到他们的IR-2形成共价键的速率慢于BTK降解速率，这很可能是由于丙烯酰胺的反应性较低。野生型和C481S突变体BTK之间不可逆PROTAC的降解功效没有显著差异，表明共价键没有参与，即在共价键还没形成时PROTAC便完成了BTK的降解。Riching的研究则支持了这一理论，他们发现靶标降解的初始速率与形成的三元复合物的稳定性和协同性呈正相关。因此，可能的说法是，已成功降解靶标的共价PROTAC是因为形成稳定的三元复合物，降解速率快于共价键形成速率，而共价键的形成则损害了靶标的降解导致三元复合物不稳定进而出现降解失败的PROTAC。

图3. 与靶蛋白不可逆共价结合的PROTAC

图片来源于Cell Chem. Biol.

与E3连接酶不可逆共价结合的PROTAC

与靶标共价结合的PROTAC可能是有效的降解剂但其失去了催化转化靶标的能力。但是，使用共价配体募集E3酶的PROTAC可能保留了共价结合和催化转化靶标的所有药代动力学优势。

在人类基因组编码的约600种E3酶中，成功的蛋白降解剂募集的不到10种，其中只有4种被广泛靶向：CRBN,VHL,IAP和MDM2。这主要是由于小分子配体的缺乏。最近人们发现了先前未靶向的E3连接酶的新配体，特别是最近已验证的E3酶RNF114,RNF4和DCA16的共价配体，与可逆E3酶募集配体相比更有优势。

使用nimbolide作为PROTAC的E3连接酶招募配体会产生有益的协同作用，从而降解靶蛋白，并通过与RNF114的Cys8共价结合来稳定抑癌基因p21和p57，实验表明抑制二者的泛素化和降解可以促进其稳定，而它们的稳定化有助于nimbolide的抗癌作用。Tong等人已证明可将nimbolide掺入降解剂中以成功募集RNF114并降解BRD4。募集MDM2的PROTAC也采用了类似的协同策略，比募集VHL的PROTAC具有更强的抗增殖作用且对相同靶标(BRD4)具有相似的降解能。为扩展招募RNF114的共价配体库，Nomura使用ABPP方法筛选了针对RNF114的Cys反应性的共价配体库，发现了EN62，该片段与nimbolide结合位点一致但需要对其通透性及选择性等进行优化。它为未来RNF114共价配体优化提供了一个良好的起点。CCW16是E3连接酶RNF4的抑制剂(IC50=1.8µM),CCW16与JQ1连接形成的PROTAC CCW28-3在竞争性ABPP分析中对RNF4的效力比原配体CCW16更高，IC50为0.54µM。对同源BET家族成员BRD2和BRD3没有降解表明其优越的选择性，且将RNF4敲除后并未观察到CCW 28-3介导的BRD4降解，进一步支持了CCW 28-3的RNF4募集机制。实验发现DCAF16的减少会显著削弱片段降解剂KB02-SLF(弹头为氯乙酰胺)介导的多泛素化合核FKB12的降解，作者还试图研究DCF16募集是否会导致其他核蛋白如BRD4的降解,结果表明PROTAC KB02-JQ1成功促进了HEK293T细胞中BRD4呈剂量依赖性降解，在DCAF16敲除细胞中降解明显减弱。这些研究强调了这些广泛反应的共价片段的实用性，可成为开发缺少配体的E3连接酶的配体的有价值的起点。(图4)

图4. 与E3连接酶不可逆共价结合的PROTAC

图片来源于Cell Chem. Biol.

与靶蛋白可逆共价结合的PROTAC

可逆共价PROTAC的研究也是在BTK靶标上研究的，只是与靶蛋白共价结合的弹头由不可逆的丙烯酰胺变为可逆的氰基丙烯酰胺。理论上讲，可逆共价PROTAC有不可逆共价PROTAC不具有的亚单位的靶标转化。

为比较不同弹头对靶标降解的影响，郭及同事设计了3种BTK PROTAC:RNC-1,RC-1和IRC-1，分别与BTK形成可逆非共价键，可逆共价键和不可逆共价键。细胞实验表明IRC-1诱导BTK降解的效率不高但RNC-1和RC-1均成功诱导了BTK降解，且低浓度上RC-1比RNC-1更有效。改变linker长度后发现最初的RC-1效果是最好的，是迄今为止最有效的BTK降解剂之一，DC50为6.6nM。生化抑制试验也有类似的结果。通过计算PROTAC的胞内浓度发现，RC-1在细胞内的蓄积比不可逆共价和可逆非共价高10倍和16倍，C=C被还原或氰基被去除的化合物作为对照，RC-1的胞内积累比对照物也要高5倍。这些结果表明，RC-1诱导的有效BTK降解及生长抑制主要归因于其高胞内浓度，突出了氰基丙烯酰胺的重要性。(图5)

图5. 与靶标可逆共价结合的PROTAC

图片来源于Cell Chem. Biol.

与E3连接酶可逆共价结合的PROTAC

Tong等人在共价E3连接酶配体的成功上，决定探索可逆E3连接酶的募集来达到避免永久性的蛋白修饰和潜在的毒性。CDDO-Me通过α-氰基烯酮部分与E3连接酶KEAP1的Cys形成可逆共价键。该活性还导致Nrf2的活化，Nrf2是氧化应激的主要调控因子，在疾病状态下被KEAP1异常泛素化，降解和抑制。因此，招募KEAP1的PROTAC可能表现出类似稳定p53的RNF114-PROTAC的有益协同机制。将CDDO通过linker连接到BET抑制剂JQ1上，该抑制剂以蛋白酶体依赖性方式成功降解了BRD4,成为第一个使用可逆共价配体募集E3连接酶的PROTAC，扩大了可配体E3连接酶的范围。(图6)

图6. 与E3连接酶可逆共价结合的PROTAC

图片来源于Cell Chem. Biol.

总结

本文回顾了可逆和不可逆化学在TPD中的最新作用，众多研究表明，使用可逆共价化学或不可逆共价抑制剂的PROTAC可能是高效的降解剂，尤其是可逆共价化学结合了共价结合和催化靶标转化的优势，还有其独特的优势如更高选择性及改善药物传递的潜力。期望在这领域取得进一步进展来阐明共价PROTAC的机制，并利用其潜力来攻克更多的难成药靶标。

参考文献

Kiely-Collins, H., Winter, G. E., Bernardes, G. J. L., The Role of Reversible and Irreversible Covalent Chemistry in Targeted Protein Degradation, Cell Chem. Biol. 2021, In press. DOI: 10.1016/j.chembiol.2021.03.005

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